細胞株的復(fù)蘇是細胞培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)：
一、前期準備
1. 人員與環(huán)境準備
- 細胞株復(fù)蘇前，需確保操作人員具備相關(guān)的專業(yè)知識和技能，熟悉細胞株的特性及復(fù)蘇流程。操作人員應(yīng)穿戴好實驗服、手套等防護裝備，做好個人防護。
- 細胞培養(yǎng)室應(yīng)保持清潔、無菌，提前用紫外線燈照射或甲醛熏蒸等方式對操作臺面、空氣等進行消毒處理。同時，要調(diào)節(jié)好培養(yǎng)室的溫度和濕度，一般溫度保持在37℃左右，相對濕度在95%以上，以提供適宜的細胞生長環(huán)境。
2. 器材與試劑準備
- 準備好細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿、移液管、離心管、吸管、酒精燈、鑷子等實驗器材，并確保其均已經(jīng)過嚴格的滅菌處理。
- 配置好相應(yīng)的培養(yǎng)基，根據(jù)細胞株的種類選擇合適的培養(yǎng)基類型和配方，加入血清、抗生素等必要的添加劑。將培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃，以提高細胞復(fù)蘇后的適應(yīng)能力。同時，準備好胰蛋白酶等消化液，以便后續(xù)對細胞進行傳代培養(yǎng)。
二、復(fù)蘇操作步驟
1. 取出凍存細胞株
- 從液氮罐中小心取出含有細胞株的凍存管，注意避免凍傷。檢查凍存管是否有裂縫或破損，如有則不能使用。
2. 快速解凍
- 迅速將凍存管放入37℃的水浴中，輕輕搖晃，使凍存液盡快融化。注意不要讓水進入凍存管內(nèi)，以免污染細胞。一般來說，在1-2分鐘內(nèi)使凍存液融化即可。
3. 轉(zhuǎn)移細胞
- 用酒精棉球擦拭凍存管外壁，然后在超凈工作臺中打開凍存管。用吸管將融化的細胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)先準備好的含有適量培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻。
4. 離心洗滌
- 將離心管放入離心機中，按照適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速(一般為800-1000轉(zhuǎn)/分鐘)離心3-5分鐘，去除上清液中的凍存液成分，以減少其對細胞的損傷。然后加入適量的培養(yǎng)基重懸細胞，再次離心洗滌，重復(fù)2-3次。
5. 接種培養(yǎng)
- 將洗滌后的細胞沉淀用適量的培養(yǎng)基重懸，制成單細胞懸液。然后根據(jù)細胞株的生長特性和實驗需求，將細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6. 觀察與記錄
- 在細胞復(fù)蘇后的最初幾個小時內(nèi)，要密切觀察細胞的形態(tài)、貼壁情況等，判斷細胞是否復(fù)蘇成功。同時，記錄細胞的生長狀態(tài)、換液時間、傳代時間等信息，以便后續(xù)對細胞株的培養(yǎng)和管理。
三、注意事項
1.細胞復(fù)蘇過程應(yīng)盡量快速完成，減少細胞在體外暴露的時間，以提高細胞的存活率。
2. 嚴格遵循無菌操作原則，避免細菌、真菌等微生物的污染。
3. 不同類型的細胞株可能具有不同的生長特性和復(fù)蘇要求，因此在復(fù)蘇前應(yīng)充分了解細胞株的相關(guān)信息，并根據(jù)實際情況調(diào)整復(fù)蘇方法和條件。
